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ELISA實驗要點:ELISA加樣操作您了解多少?
更新時間:2023-09-27瀏覽:717次

  ELISA實驗要點:ELISA加樣操作您了解多少?
 

  那在ELISA實驗中,加樣 一定是繞不開的一環(huán)!ELISA測定操作非常簡單,一般涉及到樣本的收集保存、試劑準備、加樣、溫育、洗板、顯色、結(jié)果判斷和結(jié)果報告及解釋等方面,其中任一步驟的不當都會影響測定結(jié)果,且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。

  ELISA實驗中一般需要 4 次加樣,即加樣本、加檢測抗體、加底物和加終止液。

  ● 實驗室使用的微量加樣器應(yīng)注意保養(yǎng)并定期校正。ELISA比較敏感,每孔加入液體量誤差會導致最后讀數(shù)差別,因此避免儀器帶來誤差。

  ● 加樣前,溶液充分混勻,加樣時不可90度向孔中滴加液體,否則會導致液體殘留在吸頭上,加樣不準確。正確加樣方法應(yīng)為45度,吸頭貼著孔壁和液面的交界處加入。

  ● 加樣品時,單孔用量要求:≥50ul/指標,如需要做復孔則所需樣本量≥100ul/指標。如果樣本量不充足,具體用量可咨詢您的專屬銷售。

  ● 加樣時速度不可過快,否則無法保證微量加樣的準確性和均一性。

  ● 加樣時避免液體濺出,如有樣本濺出,應(yīng)用吸水紙輕輕拭干,并做相應(yīng)記錄。

  ● 每次加樣順序一致,尤其底物、終止液順序一致,保證每個孔顯色時間相同。

  ● 加完顯色液后,放入一個可推拉的抽屜內(nèi),就可以避光振蕩了。


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  加樣防錯小竅門

  (以下問題可能因多種原因引起,本文僅討論加樣的解決方法)

  Q: 同一個樣本間的各個復孔的讀數(shù)有顯著性差異?

  A: 加樣量多少不一,操作時間長短不一。重復同一樣本時,加樣量與加樣時間理應(yīng)相同,同時也應(yīng)注意移液器的校準。加樣后可輕微晃動酶標板使反應(yīng)液充分混合。

  Q: 陽性對照讀數(shù)不正常?

  A: 加樣量不正確。應(yīng)保持每次加樣的步驟不要有太大的差異,有條件的應(yīng)該考慮使用排槍。

  Q: 血清本底高?

  A: 加樣時使用同一槍頭、交叉污染。每次吸樣注意更換吸頭,做到一樣一吸頭,避免交叉污染。

  Q: 實驗的標準曲線和測定的重復性差?

  A: 1. 可能原因:加樣本及試劑量不準;孔間不一致;校正移液器,吸嘴要配套,裝吸嘴時要緊密;重復某一樣品時,加樣時間盡可能與第一次接近;重復測定標本,操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致,以排除這些因素造成的不一致的可能性;樣品稀釋前應(yīng)充分混勻。

  2. 可能原因:加樣過快,孔間發(fā)生污染;重復測定標本,操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致,以排除這些因素造成的不一致的可能性;加樣不要過快。

  3. 可能原因:加錯樣本;檢查記錄和試劑,是否加錯樣本。

  4. 可能原因:加樣本及試劑時,加在孔壁上部非包被區(qū);加樣槍頭不要貼壁。

  ● 用一張寫滿字的紙,字越多越好,比如報紙,墊在下面,這樣,加過標本的小孔看過去下面的字會變小,沒加的字正常,非常容易區(qū)分。

  ● 可以利用液面反光與沒有加的孔加以區(qū)別。

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