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　　大鼠凋亡相關(guān)因子配體(FASL)ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)使用說明書

　　試劑盒簡(jiǎn)介

　　大鼠凋亡相關(guān)因子配體(FASL)ELISA試劑盒是一種用于體外定量檢測(cè)大鼠血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中FASL含量的實(shí)驗(yàn)工具。該試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)原理，具有高靈敏度、高特異性和良好的重復(fù)性?。

　　BS-3034大鼠凋亡相關(guān)因子配體(FASL)ELISA試劑盒

　　實(shí)驗(yàn)原理

　　本試劑盒基于雙抗體夾心法ELISA技術(shù)。預(yù)先包被的大鼠FASL抗體會(huì)與樣本中的FASL結(jié)合，再加入HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物。經(jīng)過洗滌后加入TMB底物顯色，顏色的深淺與樣品中FASL濃度呈正相關(guān)。最后在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度?。

　　試劑盒組成

　　主要組分

　　酶標(biāo)包被板：預(yù)包被抗體的96孔或48孔微孔板(2-8℃保存)

　　標(biāo)準(zhǔn)品：通常為720pg/ml或40ng/ml濃度(2-8℃保存)

　　酶標(biāo)試劑：HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體(2-8℃保存)

　　顯色劑：TMB溶液(A液和B液分開保存，2-8℃避光)

　　終止液：2M硫酸溶液(2-8℃保存)

　　濃縮洗滌液：20倍或30倍濃縮(2-8℃保存)?

　　其他配件

　　封板膜：用于反應(yīng)過程中封閉微孔板

　　密封袋：用于保存未使用的酶標(biāo)板

　　說明書：詳細(xì)操作指南?

　　樣本處理要求

　　血清樣本

　　室溫血液自然凝固10-20分鐘

　　2000-3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘

　　仔細(xì)收集上清，避免溶血

　　如出現(xiàn)沉淀，需再次離心

　　短期可2-8℃保存48小時(shí)，長(zhǎng)期需-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融?

　　血漿樣本

　　使用EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑

　　采集后30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘

　　收集上清，保存條件同血清?

　　組織勻漿

　　用預(yù)冷PBS(0.01M, pH7.4)沖洗組織，去除殘留血液

　　按1:9重量體積比加入PBS(含蛋白酶抑制劑)

　　冰上充分研磨，可超聲破碎或反復(fù)凍融輔助裂解

　　5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測(cè)?

　　實(shí)驗(yàn)操作步驟

　　試劑準(zhǔn)備

　　將所有試劑平衡至室溫(約30分鐘)

　　配制洗滌液：蒸餾水按1:20或1:25稀釋濃縮洗滌液

　　標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：按照說明書要求進(jìn)行系列倍比稀釋

　　酶標(biāo)工作液配制：臨用前按比例稀釋?

　　加樣與孵育

　　設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔

　　空白孔加樣品稀釋液，標(biāo)準(zhǔn)品孔加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，樣品孔加待測(cè)樣本

　　每孔加樣50-100μl，輕輕混勻

　　貼上封板膜，37℃孵育40-60分鐘?

　　洗滌

　　棄去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液(300μl)

　　靜置2分鐘后棄去，在濾紙上拍干

　　重復(fù)洗滌4-5次?

　　加酶標(biāo)抗體

　　每孔加入HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體工作液100μl

　　貼上封板膜，37℃孵育30分鐘

　　重復(fù)洗滌步驟?

　　顯色

　　每孔加入TMB顯色液100μl(臨用前A液1:1混合)

　　37℃避光顯色10-20分鐘(觀察顏色變化)

　　每孔加入終止液50-100μl終止反應(yīng)?

　　測(cè)定

　　終止反應(yīng)后30分鐘內(nèi)完成測(cè)定

　　酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)讀取各孔OD值

　　以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　根據(jù)樣品OD值計(jì)算FASL濃度，乘以稀釋倍數(shù)?

　　注意事項(xiàng)

　　實(shí)驗(yàn)前

　　不同批號(hào)試劑不可混用

　　試劑使用前應(yīng)充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡

　　平衡至室溫后方可使用

　　準(zhǔn)備好所有所需器材，避免實(shí)驗(yàn)中斷?

　　實(shí)驗(yàn)中

　　嚴(yán)格控制孵育時(shí)間和溫度

　　加樣準(zhǔn)確，避免孔間交叉污染

　　洗滌津，防止非特異性結(jié)合

　　顯色時(shí)間可根據(jù)顏色深淺適當(dāng)調(diào)整?

　　實(shí)驗(yàn)后

　　未用完的酶標(biāo)板條應(yīng)立即放回密封袋保存

　　廢液應(yīng)按照實(shí)驗(yàn)室規(guī)定處理

　　數(shù)據(jù)及時(shí)記錄和分析?

　　結(jié)果分析

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X軸)，對(duì)應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)(Y軸)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。推薦使用四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合，R2值應(yīng)≥0.99?。

　　計(jì)算

　　根據(jù)樣品OD值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為實(shí)際濃度。若樣品OD值超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重新測(cè)定?。

　　保存條件

　　未開封試劑盒：-℃保存，有效期6個(gè)月

　　開封后試劑：按說明書要求保存，部分需周內(nèi)用完4]

　　常見問題解決

　　高背景

　　檢查洗滌是否充分

　　確認(rèn)封閉步驟是否到位

　　. 避免酶標(biāo)抗體濃度過高

　　縮短顯色時(shí)間]

　　低信號(hào)

　　. 檢查試劑是否失效

　　. 確認(rèn)孵育時(shí)間和溫度是否足夠

　　. 樣本中目標(biāo)蛋白濃度可能過低，需濃縮樣本]

　　標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳

　　. 檢查標(biāo)準(zhǔn)品稀釋是否正確

　　2. 確認(rèn)酶標(biāo)儀功能正常

　　3. 避免顯色過度或不足]

　　注：以上資料僅供參考，如需完整版產(chǎn)品信息請(qǐng)咨詢品牌供應(yīng)商或技術(shù)老師。

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